Эффективность применения культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 при получении биогумуса

Шайбель А., Шек А.И., Галиакбарова  А.А.

ООО «БЕЛБИО», г. Белгород

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Разработка и внедрение в экономику страны новых высокоэффективных средств и методов переработки отходов сельскохозяйственного производства, твердых и жидких отходов различных отраслей промышленности и коммунального хозяйства представляет собой актуальную задачу.

В настоящее время, всестороннее изучение свойств почвенных бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis выявило у них наличие не только антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам, но и ряда других полезных свойств, делающих их перспективными для применения в различных областях экономики страны. Бактерии рода Bacillus широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в почве, а также в желудочно-кишечном тракте разных видов животных, насекомых, дождевых червей и др.

Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus) являются безвредными для организма человека и животных даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью; синтезируют более 70 видов биологически активных продуктов метаболизма, способствующих разложению органических веществ, загрязняющих окружающую среду; оказывают антитоксическое и противорадиационное действие;  стабильны при хранении.

Поэтому, создание и внедрение в экономику страны препаратов на основе селекционированных  штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis является важной проблемой.

Изучение эффективности применения культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 при получении биогумуса проводили в условиях ограниченного производственного опыта.

Культуры штаммов бацилл были предоставлены ООО «Пробиотик-Плюс» (г. Москва) в виде сухой бактериальной массы, в количестве 5 кг. Суммарное количество спор бацилл в 1 г бакмассы составляло не менее 10⁹ КОЕ.

В качестве субстрата для приготовления компоста использовали следующие компоненты:

— опилки смешанных пород древесины;

— торф низовой;

— солома злаковых культур

— сухие листья;

— навоз крупного рогатого скота.

Основные характеристики данных материалов приведены в таблице 1.

Таблица 1. Основные характеристики материалов, используемых

для приготовления компоста

Проводили микробиологическое исследование исходных составляющих компоста, путем высева водных суспензий исходных материалов на  МПА — для культивирования бактерий, на среду Чапека – для культивирования актиномицетов и грибов.

Колонии бактерий подсчитывали на третьи и на седьмые сутки (для медленнорастущих форм), актиномицеты — на седьмые и двадцатые сутки, грибы — через пять-семь суток. Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках Петри, определяли среднее количество колоний на чашке и затем делали пересчёт на один грамм исходного компонента.

Учёт спорообразующих микроорганизмов проводили тем же методом, но с предварительным прогреванием водной суспензии компонента в течение 30 минут при 80^оС.

Из посевов каждой пробы отбирали и исследовали характерные морфологические типы колоний (табл. 2).

Таблица 2. Состав микрофлоры исходных материалов компоста, КОЕ/г

Наименьшее количество микроорганизмов было обнаружено в опилках, причем только несовершенные грибы. Наиболее богат разными видами бактерий оказался навоз крупного рогатого скота. Бактерии рода Bacillus были выделены в незначительных количествах из торфа, сухих листьев и навоза.

Для компостирования отходы закладывались в пластмассовые лотки.

Площадь поверхности  лотков составляла 1 м², вместимость – 70 кг компостируемого субстрата, высота лотка – 50 см.

Исходные компоненты смешивали в различных пропорциях с использованием  бакмассы бацилл и навозных дождевых червей Eisenia fetida.

Было подготовлено 6 лотков:

— лоток № 1 – исходные материалы для компостирования и бакмасса бацилл из расчета 0,5 кг на тонну компоста;

— лоток № 2 — исходные материалы для компостирования и бакмасса бацилл из расчета 1,0 кг на тонну компоста;

— лоток № 3 — исходные материалы для компостирования и бакмасса бацилл из расчета 2,0 кг на тонну компоста;

— лоток № 4 — исходные материалы для компостирования, бакмасса бацилл из расчета 1,0 кг на тонну компоста и дождевые черви Eisenia fetida в количестве 250 шт (50 г);

— лоток № 5 — исходные материалы для компостирования и дождевые черви Eisenia fetida в количестве 250 шт (50 г);

— лоток № 6 — исходные материалы для компостирования (контроль).

Бакмассу бацилл вносили в компостируемую смесь в первый день с начала постановки опыта, а навозных дождевых червей Eisenia fetida – через 14 суток с начала постановки опыта.

Общий вес компостируемого субстрата в начале опыта во всех лотках составлял около 50 кг (табл. 3).

Таблица 3. Содержание исходных материалов в лотках для компостирования

Исходные материалы в лотках тщательно перемешивали. В течение экспериментов их влажность поддерживалась в пределах 70-80%.

Полив для поддержания влажности компоста осуществляли с помощью лейки с мелкими отверстиями, предварительно отстоявшейся в течение 3-5 суток водопроводной водой, с температурой плюс 20-24°С.

В начале процесса компостирования и в течение всего периода компостирования периодически определяли влажность и температуру.

Результаты определения влажности в исходном субстрате представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты определения влажности в исходном субстрате для компостирования

Измерение температуры внутри объема субстрата производили при помощи термометра типа СП-15.

Перед началом опыта, ежедневно в ходе опыта и по его завершении контролировали рН компостов.

В работе применяли общепринятые, апробированные в поисковых исследованиях и описанные в ГОСТ 26712-85 — ГОСТ 26718-85 методы определения физико-химических характеристик материалов, используемых  в процессе исследований, а также субстратов, приготовленных на их основе.

Массовую долю влаги и сухого остатка определяли методом, основанным на потере массы пробы при высушивании исследуемого образца субстрата  в сушильном шкафе, предварительно нагретом до температуры 105-110 ⁰С, до постоянной массы.

Золу в компостируемых составах определяли на основании потери массы пробы исследуемого образца субстрата  после прокаливания при температуре 800^оС.

Содержание общего азота определяли по методу Кьельдаля, основанному на минерализации анализируемого образца субстрата при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии перекиси водорода.

Содержание аммонийного азота определяли также по методу Кьельдаля, основанному на извлечении аммонийного азота из пробы анализируемого образца субстрата раствором соляной кислоты молярной концентрации 0,05 моль/дм³ с последующей отгонкой аммиака в раствор борной кислоты и титровании серной кислотой.

Содержание почвенного гумуса определяли по методу Тюрина, основанному на окислении органического вещества компоста хромовой кислотой до образования углекислоты.

 Содержание гуминовых веществ (Г) в процентах вычисляли по формуле:

где а – количество 0,1 н. раствора соли Мора, пошедшее на титрование 10 см³ 0,4 н. раствора К₂Сг₂О₇ при холостом анализе, см³;

в – количество 0,1 н. раствора соли Мора, пошедшее на титрование  после окисления гумуса, см³;

(а – в ) – количество 0,1 н. раствора соли Мора, соответствующее количеству хромовой кислоты, израсходованной на окисление гумуса, см³;

К – поправочный коэффициент к титру раствора соли Мора;

0,000517– количество гумуса, соответствующее 1 см³ 0,1 н. раствора соли Мора, г;

Р– масса навески, г.

В исследованиях применяли соответствующие аналитические и измерительные приборы отечественного и зарубежного производства.

Опыты проводили в трехкратной повторности. Доверительный интервал среднеарифметических значений рассчитывали с вероятностью 95 % по общепринятым методам.

Результаты исследований.

Анализ динамики изменения температуры субстратов показал, что в них происходит выделение тепла, характерное для процесса компостирования.

Процесс компостирования по этому показателю условно можно разделить на четыре этапа:

I – разогревание;

II – стабилизация;

III – остывание;

IV – созревание.

В начале процесса субстрат во всех лотках находился при температуре окружающей среды, затем температура поднималась благодаря теплоте, образующейся вследствие биологической активности микроорганизмов, присутствующих в субстрате. Продолжительность разогрева составляла 3-12 сут. (рис. 1).

Рис. 1.  Динамика изменения температуры субстратов в процессе компостирования

¨- температура субстратов в лотках № 1, 2, 3, 4, 5;

ÿ — температура субстрата в лотке № 6;

´ — температура субстрата окружающей среды.

На втором этапе, за счет изолирующего действия субстрата, выделяющаяся теплота сохраняется. В это время идет наиболее активное разложение легко распадающихся веществ, содержащихся в субстрате, таких как жиры, крахмал, белки. По мере потребления этих веществ активность микроорганизмов замедляется, температура достигает максимума. Затем компост вступает в стадию остывания, где скорость тепловыделения становится очень низкой, и температура падает до температуры окружающей среды (III этап).

Продолжительность протекания процессов компостирования на этапах разогревания, стабилизации и остывания в компостах с добавлением бакмассы бацилл (лотки №№ 1, 2, 3, 4) составила в среднем 27 сут, в вермикомпосте без добавления бакмассы бацилл (лоток № 5) — 36 сут, в контрольном компосте (лоток № 6 — без добавления бакмассы бацилл и дождевых червей) — 87 сут.

На заключительном четвёртом этапе созревание компоста проходило без нагревания.

Динамика изменения рН исследуемых компостов представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Динамика изменения рН субстратов в процессе  компостирования

¨- рН субстратов в лотках № 1, 2, 3, 4;

ÿ — рН субстрата в лотке № 5;

Ù — рН субстрата в лотке № 6.

В начале процесса компостирования рН субстрата был близок к нейтральному и составлял 6,5 — 7,2. В процессе компостирования реакция среды становилась щелочной за счет выделения аммиака при распаде белков. Резкий, характерный для аммиака запах присутствовал в течение первых двух недель, который проявляется при перемешивании компоста. На этапе остывания величина рН падала, но оставалось щелочной. Конечное значение рН компоста во всех лотках было слабощелочное.

Динамика изменений физико-химических показателей компостируемого материала приведена в таблице 4.

Таблица 4. Динамика изменений физико-химических показателей компостируемого

материала

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что физико-химические показатели компостируемого материала в лотке № 4, где при компостировании использовалась бакмасса бацилл и дождевые черви, превосходили по своим значениям показатели других, как опытных, так и контрольного компостируемых материалов.

Исследуемые физико-химические показатели компостируемого материала в лотках № 1, 2, 3 и 4, где  использовалась бакмасса бацилл,  достигали нормативных результатов через 3,5 месяца с начала процесса компостирования, и через 4,5 месяца оставались практически на одном уровне, в то время, как в компостируемом материале в лотках № 5 и № 6 через 4,5 месяца процессы гумификации продолжались.

Через 4,5 месяца с начала постановки опыта учитывали количество дождевых червей и прирост их числа  (табл. 5).

Таблица 5. Изменение численности дождевых червей и их массы

в компостируемых материалах

Как следует из данных табл. 5, прирост числа дождевых червей в компостируемом материале с внесенной в него бакмассой бацилл из расчета 1 кг сухого вещества препарата на 1  тонну компоста, на 150% выше, чем в компостируемом материале без бацилл.

Полученные данные свидетельствуют о том, что компостируемые материалы с добавлением культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 являются благоприятной средой обитания  для дождевых червей. При этом наблюдается значительное увеличение численности дождевых червей.

В ходе опыта изменения цвета, наличия пятен на поверхности тела дождевых червей, а также отклонений в их поведении не наблюдалось. Реакция на источник внешнего раздражителя у дождевых червей была активной.

Во время экспериментов происходило изменение структуры и цвета исходных компостируемых субстратов. Через 4,5 месяца с начала постановки опыта компост в лотках №№ 1, 2, 3, 4 и 5 представлял собой зернистую, рыхлую массу тёмного цвета.

Компост в лотке № 6 (контроль) был неоднородным, с включениями не гумифицированных компонентов исходных материалов (опилки, солома, листья).

Был проведен химический анализ полученных компостов для сравнения его показателей с нормативными требованиями (табл. 6).

Таблица 6. Основные показатели компостов через 4,5 месяца компостирования

Как следует из данных таблицы 6, компост из лотка № 4 по своим основным показателям превосходил  компосты из лотков №№ 1, 2, 3, 5 и 6.

Содержание гумуса в вермикомпосте с использованием бакмассы бацилл было на 5,7%  выше, чем в вермикомпосте без бацилл.

Было отмечено, что процент гуминовых веществ возрастал в компостах при увеличении количества внесенной в них бакмассы бацилл.

В сравнительном аспекте изучали состав микрофлоры опытных образцов вермикомпоста, полученного с использованием бакмассы бацилл (лоток № 4) и без микроорганизмов (лоток № 5).

Для определения общего микробного числа бактерий в вермикомпосте, его водную суспензию высевали на МПА и через сутки подсчитывали количество колоний.

Проводили идентификацию выделенных микроорганизмов по биохимическим тестам.

С целью оценки санитарно-эпидемиологического состояния вермикомпоста проводили исследования на наличие в нем условно-патогенных бактерий.

Для обнаружения санитарно-показательных бактерий пробы вермикомпоста высевали на дифференциально-диагностические среды.

Исследования проводили по методикам, утвержденным Госсанэпиднадзором России, принятым для обследования санитарного состояния почвы и воды.

Одновременно, в качестве контроля, анализировали состав микрофлоры в партии коммерческого биогумуса и садово-огородной земли.

Для проведения микробиологического анализа отбирали 1 г вермикомпоста, растирали в фарфоровой ступке с небольшим количеством физиологического раствора, доводили объем до 100 см³. Водную суспензию встряхивали в течение 20-30 мин. Посев  проводили из разведений от 1:10 до 1:1000000.

Бактерии подсчитывали через 3-5 сут. культивирования, актиномицеты — через 7-20 сут. Подсчитав колонии в трех параллелях, определяли среднее количество на чашке, затем пересчитывали на 1 г воздушно-сухого вермикомпоста.

Данные микробиологического  анализа вермикомпостов представлены в таблице 7.

Таблица 7.  Микробиологический состав образцов вермикомпостов

и садово-огородной земли

Грамположительные бактерии в вермикомпосте (лоток № 4 и № 5) были представлены двумя видами бацилл — Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, являющихся компонентами пробиотической кормовой добавки ОЛИН. В коммерческом биогумусе были обнаружены Bacillus cereus и Bacillus mucoides, в садово-огородной земле — Bacillus subtilis и Bacillus cоagulans.

Грамотрицательная микрофлора и актиномицеты в опытных вермикомпостах не были обнаружены.

В коммерческом биогумусе и в почве были обнаружены гнилостные бактерии родов Pseudomonas и Acinetobacter.

В вермикомпосте, полученном с помощью культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 и дождевых червей, актиномицетов было в 2 раза больше, чем в вермикомпосте, полученном только при участии дождевых червей, и в коммерческом биогумусе и в 14,2 раза больше, чем в садово-огородной земле.

Преобладание в микробном составе актиномицетов характерно для гумифицированных почв.

Данные анализа показывают, что микробиологический состав вермикомпоста, полученного на основе культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 и дождевых червей, соответствует микробиологическому составу плодородных почв с естественным содержанием гумуса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. В процессе компостирования отходов вначале происходит разрушение легко усваиваемых соединений — сахаров, полисахаридов, затем белков и гемицеллюлоз. Разложение сопровождается синтезом комплекса гуминовых соединений. В результате масса органического вещества уменьшается, компост обогащается азотом, гумусом, возрастает его зольность. Меняется структура органических соединений в вермикомпостах: они размельчаются, из них в результате деятельности дождевых червей, образуются зернистые агрегаты.
2. В начале процесса компостирования рН субстрата был близок к нейтральному и составлял 6,5-7,2 ед. рН. В процессе компостирования реакция среды становилась щелочной за счет выделения аммиака при распаде белков. Характерный для аммиака запах присутствовал в компостах в течение 14 сут. На этапе остывания величина рН падала, но оставалось щелочной. Конечное значение рН компоста во всех лотках было слабощелочное.
3. Продолжительность протекания процессов компостирования на этапах разогревания, стабилизации и остывания в компостах с добавлением культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 была на 9 сут. короче, чем в вермикомпосте без добавления бакмассы бацилл и на 60 сут. короче, чем в контрольном компосте (без добавления бацилл и дождевых червей), и составила в среднем 27 сут.
4. При изучении физико-химических показателей компостируемых материалов через 1,5; 2; 3,5 и 4,5 месяцев с начала постановки опыта в вермикомпосте с добавлением культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 содержание золы и гуминовых веществ было выше, чем в других опытных и контрольном компостах во все дни исследований.
5. Исследуемые физико-химические показатели компостируемых материалов с добавлением бацилл достигали нормативных значений через 3,5 месяца с начала процесса компостирования, и через 4,5 месяца оставались практически на одном уровне, в то время, как в вермикомпосте без добавления культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 и в контрольном компосте через 4,5 месяца процессы гумификации продолжались.
6. Компостируемые материалы с добавлением бацилл являются благоприятной средой обитания для дождевых червей. Прирост числа дождевых червей в компостируемом материале с внесенным в него бакмассы бацилл из расчета 1 кг на 1 тонну компоста, был на 150% выше, чем в компостируемом материале без бацилл.
7. Содержание гумуса в вермикомпосте с использованием культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 на 5,7% выше, чем в вермикомпосте без бацилл.
8. Процент гуминовых веществ в компостах возрастает при увеличении количества внесенной в них бакмассы бацилл.
9. Микробиологический состав вермикомпоста, полученного на основе культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 и дождевых червей, соответствует микробиологическому составу плодородных почв с естественным содержанием гумуса. В вермикомпосте, полученном с помощью бацилл и дождевых червей, концентрация актиномицетов была в 2 раза выше, чем в вермикомпосте, полученном только при участии дождевых червей. Преобладание в микробном составе компостов актиномицетов характерно для гумифицированных почв.
10. Применение бакмассы культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 из расчета 1 кг на тонну компостируемого материала с использованием дождевых червей сокращает сроки компостирования не менее чем на 1,5 месяца.